Virális gének expressziós szabályozásában résztvevő fehérje komplexek szerkezeti és funkcionális analízise Staphylococcus aureus-ban Kémiai és Vegyipari

31 OTDK, Kémiai és Vegyipari Szekció, Biokémia 1 Tagozat.

Virális gének expressziós szabályozásában résztvevő fehérje komplexek szerkezeti és funkcionális analízise Staphylococcus aureus-ban

Hallgató: Bendes Ábris Ádám
Szak: Biomérnök, Képzés típusa: bsc, Intézmény: Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Kar: Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar

Témavazető: Dr. Vértessy G. Beáta - egyetemi tanár, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar

A Staphylococcus aureus egy fakultatív anaerob Gram-pozitív baktérium, mely a normál bőrflóra komponenseként gyakran megjelenik, ennél fogva az emberiség 20%-a hosszú távú hordozója ennek a mikroorganizmusnak. A S. aureus számos betegség kórokozója lehet, melyek között életveszélyes lefolyású fertőzések is előfordulhatnak, mint például tüdőgyulladás, vagy az agyhártyagyulladás. A sztafilokokkuszok genomjában előforduló szuperantigén-hordozó patogenitás szigetek (SaPI) jelentős szerepet játszanak a populációk közti virulencia gének terjedésében. Legújabb kutatások szerint a szigetekben kódolt gének átíródását specifikus represszor fehérjék (Stl) szabályozzák. A derepresszió egy virális dUTPázzal való fehérje-fehérje kölcsönhatás során történik, mely a dUTPáz nem-konvencionális szerepére enged következtetni.

Munkám során a S. aureus Ф11 helper fág dUTPáz és az Stl SaPIbov1 represszor fehérje kölcsönhatását és szerkezetét vizsgáltam in vitro rendszerekben.

A vizsgálandó fehérjéket E. coli-ban termeltem rekombináns módszerekkel (pET-15b és pETDuet-1 vektor-rendszerben). A fehérjék nagy hatékonyságú tisztítását, vektortól függően, Ni-NTA HisTrap gyantán vagy ioncserélő oszlopon végeztem és gélszűréssel növeltem tovább a tisztaságot.

A háromdimenziós térszerkezet felderítésére irányuló munkám során kristályosítási kísérleteket végeztem mind az Stl SaPIbov1-el, mind a Ф11 dUTPázzal önmagában és komplexben is, a nyert kristályokkal röntgendiffrakciós méréseket folytattam. A másodlagos szerkezet meghatározására távoli-UV cirkuláris dikroizmus spektroszkópiát (CD) használtam.

Funkcionális vizsgálatok során fenolvörös indikátor alapú aktivitás assay-el méréseket végeztem a Ф11 dUTPáz dUTP hidrolizáló aktivitásának meghatározására a kölcsönható partnerének jelenlétében és távollétében. Termofluor kísérletekkel meghatároztam a különálló fehérjék és a komplex olvadási hőmérsékleteit: analizáltam a Ф11 dUTPáz és a komplex stabilitásának változását lassan hidrolizáló dUTP analóg jelenléte mellett.

A S. aureus specifikus fágok dUTPáz szekvenciáit in silico módszerekkel hasonlítottam össze, több mint 60 virális dUTPáz szekvencia illesztésén keresztül. Szerkezeti hasonlóság és az irodalmi adatok alapján csoportosítottam és filogenetikailag vizsgáltam a szekvenciákat.

Munkám célja mélyebb belátást nyújtani a S. aureus patogenitásának és annak fág mediált terjedésének szabályozásába, és az esetleges okozott fertőzések kezelési módjainak egy új irányú megközelítésébe.