A FliI fehérje klónozása, termeltetése és tisztítása Biológia

31 OTDK, Biológia Szekció, Molekuláris biológia II Tagozat.

A FliI fehérje klónozása, termeltetése és tisztítása

Hallgató: Kovács Mátyás
Szak: Biomérnöki BSc, Képzés típusa: bsc, Intézmény: Pannon Egyetem, Kar: Mérnöki Kar

Témavazető: Dr. Vonderviszt Ferenc - egyetemi tanár, Pannon Egyetem Műszaki Informatikai Kar

A baktériumok flagellumok segítségével mozognak, amelyek egy a sejtmembránban elhelyezkedő molekuláris motorból és a hozzá kapcsolódó helikális filamentumból állnak. A filamentum több ezer flagellinből és néhány egyéb fehérje alegységből áll, amelyek a citoplazmában szintetizálódnak és egy speciális exportrendszer segítségével a helikális filamentum belső csatornáján keresztül jutnak el a beépülési helyükre a filamentum végére.

Az exportrendszer kulcsfontosságú eleme a FliI ATPáz. Ez egy 49 kDa nagyságú fehérje, melynek N-terminális szegmense 110 aminosavból áll, ez felelős az egyéb flagelláris fehérjékkel való kölcsönhatásért, centrális régiója pedig ATPáz aktivitással rendelkezik. A FliI az ATP hidrolízise során felszabaduló energia segítségével végzi az exportálódó fehérjekomponensek kitekerését és bejuttatását az exportcsatornába.

A korábbi tisztítási eljárásoknál problémaként lépett fel a FliI aggregációja és érzékeny N-terminális régiójának elemésztődése. Munkám során génsebészeti módszerekkel a glutation-S-transzferáz (GST) fehérjét a FliI N-terminális régiójához fúzionáltattam, így a GST megvédi a fehérje sérülékeny N-terminális részét és elősegíti annak feltekeredését, s mindezek mellett lehetővé teszi a fehérje affinitás kromatográfiás tisztítását glutation tartalmú oszlopon. A FliI és a GST közé a TEV proteáz enzim specifikus hasító helyét illesztettem, amelynek révén a GST toldalék a fúziós fehérje izolálása után proteolitikus emésztéssel egyszerűen eltávolítható. Feladatom volt még a GST-FliI fúziós fehérje nagy mennyiségű bakteriális termeltetése és tisztítása. Az így előállított FliI olyan vizsgálatok alapjául szolgálhat, amelyekkel tisztázhatjuk szerepét a flagelláris exportszubsztrátumok felismerésében és kijuttatásában.

Kulcsszavak: FliI ATPáz, exportrendszer, GST-FliI fúziós fehérje